Методика постановки РИФ-200. Кровь берут из вены в чистую и сухую пробирку в объеме 5 мл и обрабатывают как для реакции Вассермана. Инактивируют сыворотку однократно в течение 30 мин при температуре 56°С. Хранят при температуре +4 °С или –20°С. Во время лечения больных пенициллином иногда могут быть получены ложноотрицательные результаты реакции, поэтому в этих условиях РИФ проводить не следует.
Антиген. В качестве антигена используют взвесь патогенных бледных трепонем штамма Никольса из 7-суточного орхита кролика. Получение и хранение антигена требует соблюдения условий стерильности, так как с одним и тем же антигеном реакция ставится в течение длительного времени. (Антиген может быть получен в ампулах из ближайшей лаборатории, где ставят РИФ). Перед каждой постановкой реакции взвесь хорошо перемешивают и исследуют в темном поле зрения для определения ее густоты. Для РИФ необходимо иметь 40-60 трепонем в темном поле зрения, и, если взвесь более густая, то ее разводят изотоническим раствором натрия хлорида, (рН 7,2). Разводить надо только то количество антигена, которое необходимо для постановки реакции.
Антивидовая флюоресцирующая сыворотка. В реакции необходима меченная флюорохромом сыворотка крови животных, иммунизированных сывороточным белком человека. Лиофильно высушенную флюоресцирующую сыворотку растворяют при соблюдении условий стерильности в дистиллированной воде, в том объеме, который указан на этикетке ампул, переливают в стерильную пробирку с корковой или резиновой пробкой и в процессе использования хранят в холодильнике при температуре –4 °С. В день постановки реакции нужное количество сыворотки разводят по титру дистиллированной водой. Титр каждой серии необходимо определять. Для этого берут 5 сывороток крови больных сифилисом и 5 сывороток здоровых людей, разводят их изотоническим раствором натрия хлорида в 200 раз и ставят реакцию с использованием во второй фазе различных разведении флюоресцирующей сыворотки против сывороточных глобулинов человека той серии, титр которой определяется. Окончательным титром можно считать тот, который проверен на 100 исследуемых сыворотках, из которых не менее 20 должно быть от больных сифилисом.
Техника постановки реакции. Из антигена готовят препараты на тонких, хорошо обезжиренных предметных стеклах, на обратной стороне которых обозначены кружки диаметром 1 см. Запаянным концом пастеровской пипетки круговыми движениями распределяют антиген в пределах кружка, и высушенный на воздухе мазок фиксируют в течение 5 мин в чистом ацетоне. После фиксации стекла помещают во влажную камеру. Инактивированные испытуемые сыворотки крови разводят в 200 раз изотоническим раствором натрия хлорида. Для проведения первой фазы реакции на помещенные во влажную камеру препараты наносят испытуемые сыворотки. Для того, чтобы покрыть препарат, достаточно 1 капли сыворотки. После этого влажную камеру закрывают и помещают в термостат при температуре 35°С на 30 мин. По истечении этого времени препараты вынимают из влажной камеры, промывают в течение 10 мин в двух порциях изотонического раствора натрия хлорида и помешают в штатив для высушивания. После высушивания препараты вновь помещают во влажную камеру и наносят по капле разведенной по титру флюоресцирующей сыворотки против глобулинов человека. Вторую фазу реакции проводят при комнатной температуре, после чего препараты 10 мин промывают в изотоническом растворе натрия хлорида, высушивают и монтируют для люминесцентной микроскопии. Монтирование препаратов заключается в том, что на них стеклянной палочкой наносят маленькие капли забуференного глицерина (1 часть фосфатного буфера при рН 7,4 и 9 частей глицерина), накрывают их тонкими, хорошо обезжиренными предметными стеклами, на которые стеклянной палочкой наносят по капле нелюминесцирующее иммерсионное масло (диметилфталат). Исследование препаратов производят в люминесцентном микроскопе или в люминесцентном устройстве ОЙ-17. Степень свечения трепонем, зависящая от количества антител в сыворотке крови, обозначается плюсами. Свечение считается положительным, если его оценивают как 4+, 3+ и 2+.

Реакция иммунофлюоресценции-абсорбции с бледной трепонемой (FTA-ABS). Используемый для реакции антиген представляет собой взвесь бледных трепонем из пораженных сифилисом яичек кролика, фиксированную ацетоном на предметном стекле. Можно также использовать лиофилизированные бледные трепонемы после их восстановления в изотоническом растворе натрия хлорида. Инакти-вированную сыворотку инкубируют с сорбентом (трепонемы Рейтера) для абсорбирован ия неспецифических групповых антител. Затем сыворотку помещают пипеткой на антиген, находящийся на предметном стекле. Специфические антитела (глобулины) связываются бледными трепонемами. После промывания ктрепонемам на предметном стекле добавляют комплекс античеловеческого глобулина с флюоресцентным красителем (флюоресцеин-изотиоцианат). Этот комплекс связывается с человеческим глобулином на оболочке клеток бледных трепонем и может быть идентифицирован методом флюоресцентной микроскопии. По прошествии не менее 2 ч по степени флюоресценции сыворотку можно классифицировать как нереактоспособную, пограничную или реактоспособную. Реакция, обозначаемая двумя плюсами или больше, свидетельствует об инфекции.
Появления реактоспособности можно ожидать примерно в начале 3-й недели после заражения, а у нелеченных больных она обнаруживается постоянно. Сыворотка остается реактоспособной и через несколько лет после успешного лечения раннего сифлиса, а у больных, получивших адекватное лечение при позднем сифилисе, – на протяжении десятилетий.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135