Перед началом работы, связанной с приготовлением антигена из бледных трепонем, в кастрюлю объемом 2-3 л наливают на 2/3 дистиллированной воды и в процессе работы складывают в нее колбы, пробирки, пипетки, предметные стекла, загрязненные антигеном. Готовят также почкообразный тазик, заливаемый на 2/3 дистиллированной водой, куда складывают покровные стекла после работы. Приготовление препарата для подсчета бледных трепонем необходимо проводить с максимальной точностью, так как при неточном разливе ингредиентов, при избытке или недостатке исследуемого материала в препарате можно получить недостоверные результаты. Учет результатов следует проводить в день постановки реакции, лучше всего тут же после центрифугирования, так как при длительном стоянии пробирок (15-24 ч) возможны ложноположительные результаты. Покровные стекла должны иметь размеры только 24х24 мм. Надосадочную жидкость берут микропипеткой объемом 0,1 мл.
Для постановки реакции используются следующие ингредиенты: испытуемая сыворотка, антиген, комплемент, эритроциты донора, изотонический раствор натрия хлорида. Кровь берут из вены и обрабатывают, как для реакции Вассермана. Сыворотку крови инактивируют в водяной бане при температуре 55-56°С в течение 30 мин.
В качестве антигена используют взвесь бледных трепонем штамма Никольса. Здоровым кроликам интратестикулярно вводят по 0,75-1 мл взвеси бледных трепонем, содержащей не менее 60-70 особей в поле зрения. На 7-12-й день кролика забивают воздушной эмболией, вводя 20 см 3 воздуха в ушную вену. Яички удаляют, очищают от оболочек, жира, освобождают от придатков и разрезают на мелкие кусочки, которые затем помещают в стерильную колбу, заливают 10-15 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида. После этого всю жидкость из колбы отсасывают пипеткой в пробирку и определяют в ней число бледных трепонем. Для этого микропи-геткой из пробирки наливают 0,01 мл на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и смотрят в темном поле зрения. Если число бледных трепонем в поле зрения достигает 100, то в колбу с тканями яичка добавляют 50 мл, а если 50, то 20-25 мл стерильного изотонического раствора натрия хлорида и производят встряхивание в шюттель-аппарате в течение 50 мин. Первую порцию взвеси бледных трепонем уничтожают (она не может быть использована в качестве антигена). Вторую порцию жидкости, полученную при экстрагировании, отсасывают стерильной пипеткой, разливают в химические пробирки и снова определяют в ней число бледных трепонем в поле зрения. При наличии в этой порции жидкости 50-100 бледных трепонем яички можно подвергать повторным экстрагированиям с новыми порциями изотонического раствора натрия хлорида до тех пор, пока в антигене не будет не менее 20 бледных трепонем в поле зрения. После каждого экстрагирования жидкость из колбочки отсасывают пипеткой в стерильные химические пробирки и центрифугируют при 1000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отсасывают (или сливают) из всех пробирок в одну стерильную колбочку, прогревают при температуре 56°С в течение 30 мин, и в ней определяют число бледных трепонем в темном поле зрения, просматривая 10 полей зрения. Ампулирование производят сразу или на 2-3-й день после приготовления антигена. На ампулах с антигеном обозначают серию антигена, дату его изготовления и среднее число бледных трепонем в одном поле зрения. Перед каждой постановкой РИП необходимо определять количество бледных трепонем в антигене. Рабочий антиген должен содержать 15-20 бледных трепонем в поле зрения. Антиген применяется в дозе 0,3 мл для каждой испытуемой сыворотки. Расчет необходимого количества антигена делается в день постановки реакции. Например, для исследования 50 сывороток крови нужно 0,3х55, что в результате дает 16,5 мл рабочего антигена (поскольку необходимо взять на 5 пробирок больше с учетом контролей и случайных потерь).
Комплемент растворяют согласно указанию на этикетке, вводят в дозе 0,05 мл в опыт. Так, для исследования 50 сывороток крови необходимо 0,05 мл х 55, т. е. 2,75 мл комплемента. Взвесь эритроцитов готовят так: применяется только цитратная кровь донора 0(1) группы, которую взбалтывают до получения однородной смеси, наливают в центрифужные пробирки и трижды отмывают изотоническим раствором натрия хлорида. Надосадочная жидкость должна быть прозрачной и негемолизированной. Из осадка отмытых эритроцитов готовят 50 % взвесь их в изотоническом растворе натрия хлорида, которую наливают в пробирки в дозе 0,1 мл для каждой испытуемой сыворотки. Расчет необходимого количества эритроцитов для 50 сывороток производят следующим образом: 0,1 мл х 55, получается 5,5 мл (в данном случае 3 мл отмытых эритроцитов и 3 мл изотонического раствора).
Техника постановки. Предварительно для реакции разводят все ингредиенты. На дно центрифужной пробирки микропипеткой наливают 0,05 мл испытуемой сыворотки, добавляют 0,35 мл смеси комплемента (0,05 мл) с антигеном (0,3 мл). Пробирки энергично встряхивают в течение 30 с и оставляют при комнатной температуре на 30 мин; затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл взвеси эритроцитов, пробирки энергично встряхивают в течение 30 с и оставляют в термостате при температуре 37°С на 30 мин, после чего все пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 3 мин.
Учет результатов проводят путем подсчета бледных трепонем в надосадочной жидкости. Для этого 0,01 мл надосадочной жидкости микропипеткой наносят на предметное стекло, покрывают покровным стеклом и в темном поле зрения подсчитывают число бледных трепонем в 10 полях зрения. Для облегчения подсчета рекомендуется использовать 11-клавишный лейкоцитарный счетчик.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135